DESİGNİNG THE FUSİON PROTEİN :
1.
KLONLANACAK DNA DİZİSİ VE ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
- Klonlanacak diziyi içeren NCBI referans sekans kodu NM_002303 olan Homo sapiens leptin receptor (LEPR) (transcript variant 1, mRNA) geninin CDS (kodlayan sekans dizisi) dizisi çıkarılır. Protein kodlayan ilk 105 baz insert olarak kullanılacağı için başlangıç kodonu olan ilk ''atg'' diziliminden başlanarak 105 bazlık dizi işaretlenir (sarı renkli arka plan).
- Bu dizi ile birlikte kullanılması uygun restriksiyon enzimleri ve vektörler belirlenir.
ORIGIN
1 ccggtctggc ttgggcaggc tgcccgggcc gtggcaggaa gccggaagca gccgcggccc 61 cagttcggga gacatggcgg gcgttaaagc tctcgtggca ttatccttca gtggggctat 121 tggactgact tttcttatgc tgggatgtgc cttagaggat tatgggtgta cttctctgaa 181 gtaagatgat ttgtcaaaaa ttctgtgtgg ttttgttaca ttgggaattt atttatgtga 241 taactgcgtt taacttgtca tatccaatta ctccttggag atttaagttg tcttgcatgc 301 caccaaattc aacctatgac tacttccttt tgcctgctgg actctcaaag aatacttcaa 361 attcgaatgg acattatgag acagctgttg aacctaagtt taattcaagt ggtactcact 421 tttctaactt atccaaaaca actttccact gttgctttcg gagtgagcaa gatagaaact 481 gctccttatg tgcagacaac attgaaggaa agacatttgt ttcaacagta aattctttag 541 tttttcaaca aatagatgca aactggaaca tacagtgctg gctaaaagga gacttaaaat 601 tattcatctg ttatgtggag tcattattta agaatctatt caggaattat aactataagg 661 tccatctttt atatgttctg cctgaagtgt tagaagattc acctctggtt ccccaaaaag 721 gcagttttca gatggttcac tgcaattgca gtgttcatga atgttgtgaa tgtcttgtgc 781 ctgtgccaac agccaaactc aacgacactc tccttatgtg tttgaaaatc acatctggtg 841 gagtaatttt ccagtcacct ctaatgtcag ttcagcccat aaatatggtg aagcctgatc 901 caccattagg tttgcatatg gaaatcacag atgatggtaa tttaaagatt tcttggtcca 961 gcccaccatt ggtaccattt ccacttcaat atcaagtgaa atattcagag aattctacaa 1021 cagttatcag agaagctgac aagattgtct cagctacatc cctgctagta gacagtatac 1081 ttcctgggtc ttcgtatgag gttcaggtga ggggcaagag actggatggc ccaggaatct 1141 ggagtgactg gagtactcct cgtgtcttta ccacacaaga tgtcatatac tttccaccta 1201 aaattctgac aagtgttggg tctaatgttt cttttcactg catctataag aaggaaaaca 1261 agattgttcc ctcaaaagag attgtttggt ggatgaattt agctgagaaa attcctcaaa 1321 gccagtatga tgttgtgagt gatcatgtta gcaaagttac ttttttcaat ctgaatgaaa 1381 ccaaacctcg aggaaagttt acctatgatg cagtgtactg ctgcaatgaa catgaatgcc 1441 atcatcgcta tgctgaatta tatgtgattg atgtcaatat caatatctca tgtgaaactg 1501 atgggtactt aactaaaatg acttgcagat ggtcaaccag tacaatccag tcacttgcgg 1561 aaagcacttt gcaattgagg tatcatagga gcagccttta ctgttctgat attccatcta 1621 ttcatcccat atctgagccc aaagattgct atttgcagag tgatggtttt tatgaatgca 1681 ttttccagcc aatcttccta ttatctggct acacaatgtg gattaggatc aatcactctc 1741 taggttcact tgactctcca ccaacatgtg tccttcctga ttctgtggtg aagccactgc 1801 ctccatccag tgtgaaagca gaaattacta taaacattgg attattgaaa atatcttggg 1861 aaaagccagt ctttccagag aataaccttc aattccagat tcgctatggt ttaagtggaa 1921 aagaagtaca atggaagatg tatgaggttt atgatgcaaa atcaaaatct gtcagtctcc 1981 cagttccaga cttgtgtgca gtctatgctg ttcaggtgcg ctgtaagagg ctagatggac 2041 tgggatattg gagtaattgg agcaatccag cctacacagt tgtcatggat ataaaagttc 2101 ctatgagagg acctgaattt tggagaataa ttaatggaga tactatgaaa aaggagaaaa 2161 atgtcacttt actttggaag cccctgatga aaaatgactc attgtgcagt gttcagagat 2221 atgtgataaa ccatcatact tcctgcaatg gaacatggtc agaagatgtg ggaaatcaca 2281 cgaaattcac tttcctgtgg acagagcaag cacatactgt tacggttctg gccatcaatt 2341 caattggtgc ttctgttgca aattttaatt taaccttttc atggcctatg agcaaagtaa 2401 atatcgtgca gtcactcagt gcttatcctt taaacagcag ttgtgtgatt gtttcctgga 2461 tactatcacc cagtgattac aagctaatgt attttattat tgagtggaaa aatcttaatg 2521 aagatggtga aataaaatgg cttagaatct cttcatctgt taagaagtat tatatccatg 2581 atcattttat ccccattgag aagtaccagt tcagtcttta cccaatattt atggaaggag 2641 tgggaaaacc aaagataatt aatagtttca ctcaagatga tattgaaaaa caccagagtg 2701 atgcaggttt atatgtaatt gtgccagtaa ttatttcctc ttccatctta ttgcttggaa 2761 cattattaat atcacaccaa agaatgaaaa agctattttg ggaagatgtt ccgaacccca 2821 agaattgttc ctgggcacaa ggacttaatt ttcagaagcc agaaacgttt gagcatcttt 2881 ttatcaagca tacagcatca gtgacatgtg gtcctcttct tttggagcct gaaacaattt 2941 cagaagatat cagtgttgat acatcatgga aaaataaaga tgagatgatg ccaacaactg 3001 tggtctctct actttcaaca acagatcttg aaaagggttc tgtttgtatt agtgaccagt 3061 tcaacagtgt taacttctct gaggctgagg gtactgaggt aacctatgag gacgaaagcc 3121 agagacaacc ctttgttaaa tacgccacgc tgatcagcaa ctctaaacca agtgaaactg 3181 gtgaagaaca agggcttata aatagttcag tcaccaagtg cttctctagc aaaaattctc 3241 cgttgaagga ttctttctct aatagctcat gggagataga ggcccaggca ttttttatat 3301 tatcagatca gcatcccaac ataatttcac cacacctcac attctcagaa ggattggatg 3361 aacttttgaa attggaggga aatttccctg aagaaaataa tgataaaaag tctatctatt 3421 atttaggggt cacctcaatc aaaaagagag agagtggtgt gcttttgact gacaagtcaa 3481 gggtatcgtg cccattccca gccccctgtt tattcacgga catcagagtt ctccaggaca 3541 gttgctcaca ctttgtagaa aataatatca acttaggaac ttctagtaag aagacttttg 3601 catcttacat gcctcaattc caaacttgtt ctactcagac tcataagatc atggaaaaca 3661 agatgtgtga cctaactgtg taatttcact gaagaaacct tcagatttgt gttataatgg 3721 gtaatataaa gtgtaataga ttatagttgt gggtgggaga gagaaaagaa accagagtca 3781 aatttgaaaa taattgttcc aaatgaatgt tgtctgtttg ttctctctta gtaacataga 3841 caaaaaattt gagaaagcct tcataagcct accaatgtag acacgctctt ctattttatt 3901 cccaagctct agtgggaagg tcccttgttt ccagctagaa ataagcccaa cagacaccat 3961 cttttgtgag atgtaattgt tttttcagag ggcgtgttgt tttacctcaa gtttttgttt 4021 tgtaccaaca cacacacaca cacacattct taacacatgt ccttgtgtgt tttgagagta 4081 tattatgtat ttatattttg tgctatcaga ctgtaggatt tgaagtagga ctttcctaaa 4141 tgtttaagat aaacagaatt c >gi|310923184:186-3683 Homo sapiens leptin receptor (LEPR), transcript variant 1, mRNA ATGATTTGTCAAAAATTCTGTGTGGTTTTGTTACATTGGGAATTTATTTATGTGATAACTGCGTTTAACT TGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGCATGCCACCAAATTCAACCTATGACTACTT CCTTTTGCCTGCTGGACTCTCAAAGAATACTTCAAATTCGAATGGACATTATGAGACAGCTGTTGAACCT AAGTTTAATTCAAGTGGTACTCACTTTTCTAACTTATCCAAAACAACTTTCCACTGTTGCTTTCGGAGTG AGCAAGATAGAAACTGCTCCTTATGTGCAGACAACATTGAAGGAAAGACATTTGTTTCAACAGTAAATTC TTTAGTTTTTCAACAAATAGATGCAAACTGGAACATACAGTGCTGGCTAAAAGGAGACTTAAAATTATTC ATCTGTTATGTGGAGTCATTATTTAAGAATCTATTCAGGAATTATAACTATAAGGTCCATCTTTTATATG TTCTGCCTGAAGTGTTAGAAGATTCACCTCTGGTTCCCCAAAAAGGCAGTTTTCAGATGGTTCACTGCAA TTGCAGTGTTCATGAATGTTGTGAATGTCTTGTGCCTGTGCCAACAGCCAAACTCAACGACACTCTCCTT ATGTGTTTGAAAATCACATCTGGTGGAGTAATTTTCCAGTCACCTCTAATGTCAGTTCAGCCCATAAATA TGGTGAAGCCTGATCCACCATTAGGTTTGCATATGGAAATCACAGATGATGGTAATTTAAAGATTTCTTG GTCCAGCCCACCATTGGTACCATTTCCACTTCAATATCAAGTGAAATATTCAGAGAATTCTACAACAGTT ATCAGAGAAGCTGACAAGATTGTCTCAGCTACATCCCTGCTAGTAGACAGTATACTTCCTGGGTCTTCGT ATGAGGTTCAGGTGAGGGGCAAGAGACTGGATGGCCCAGGAATCTGGAGTGACTGGAGTACTCCTCGTGT CTTTACCACACAAGATGTCATATACTTTCCACCTAAAATTCTGACAAGTGTTGGGTCTAATGTTTCTTTT CACTGCATCTATAAGAAGGAAAACAAGATTGTTCCCTCAAAAGAGATTGTTTGGTGGATGAATTTAGCTG AGAAAATTCCTCAAAGCCAGTATGATGTTGTGAGTGATCATGTTAGCAAAGTTACTTTTTTCAATCTGAA TGAAACCAAACCTCGAGGAAAGTTTACCTATGATGCAGTGTACTGCTGCAATGAACATGAATGCCATCAT CGCTATGCTGAATTATATGTGATTGATGTCAATATCAATATCTCATGTGAAACTGATGGGTACTTAACTA AAATGACTTGCAGATGGTCAACCAGTACAATCCAGTCACTTGCGGAAAGCACTTTGCAATTGAGGTATCA TAGGAGCAGCCTTTACTGTTCTGATATTCCATCTATTCATCCCATATCTGAGCCCAAAGATTGCTATTTG CAGAGTGATGGTTTTTATGAATGCATTTTCCAGCCAATCTTCCTATTATCTGGCTACACAATGTGGATTA GGATCAATCACTCTCTAGGTTCACTTGACTCTCCACCAACATGTGTCCTTCCTGATTCTGTGGTGAAGCC ACTGCCTCCATCCAGTGTGAAAGCAGAAATTACTATAAACATTGGATTATTGAAAATATCTTGGGAAAAG CCAGTCTTTCCAGAGAATAACCTTCAATTCCAGATTCGCTATGGTTTAAGTGGAAAAGAAGTACAATGGA AGATGTATGAGGTTTATGATGCAAAATCAAAATCTGTCAGTCTCCCAGTTCCAGACTTGTGTGCAGTCTA TGCTGTTCAGGTGCGCTGTAAGAGGCTAGATGGACTGGGATATTGGAGTAATTGGAGCAATCCAGCCTAC ACAGTTGTCATGGATATAAAAGTTCCTATGAGAGGACCTGAATTTTGGAGAATAATTAATGGAGATACTA TGAAAAAGGAGAAAAATGTCACTTTACTTTGGAAGCCCCTGATGAAAAATGACTCATTGTGCAGTGTTCA GAGATATGTGATAAACCATCATACTTCCTGCAATGGAACATGGTCAGAAGATGTGGGAAATCACACGAAA TTCACTTTCCTGTGGACAGAGCAAGCACATACTGTTACGGTTCTGGCCATCAATTCAATTGGTGCTTCTG TTGCAAATTTTAATTTAACCTTTTCATGGCCTATGAGCAAAGTAAATATCGTGCAGTCACTCAGTGCTTA TCCTTTAAACAGCAGTTGTGTGATTGTTTCCTGGATACTATCACCCAGTGATTACAAGCTAATGTATTTT ATTATTGAGTGGAAAAATCTTAATGAAGATGGTGAAATAAAATGGCTTAGAATCTCTTCATCTGTTAAGA AGTATTATATCCATGATCATTTTATCCCCATTGAGAAGTACCAGTTCAGTCTTTACCCAATATTTATGGA AGGAGTGGGAAAACCAAAGATAATTAATAGTTTCACTCAAGATGATATTGAAAAACACCAGAGTGATGCA GGTTTATATGTAATTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTTCCATCTTATTGCTTGGAACATTATTAATATCAC ACCAAAGAATGAAAAAGCTATTTTGGGAAGATGTTCCGAACCCCAAGAATTGTTCCTGGGCACAAGGACT TAATTTTCAGAAGCCAGAAACGTTTGAGCATCTTTTTATCAAGCATACAGCATCAGTGACATGTGGTCCT CTTCTTTTGGAGCCTGAAACAATTTCAGAAGATATCAGTGTTGATACATCATGGAAAAATAAAGATGAGA TGATGCCAACAACTGTGGTCTCTCTACTTTCAACAACAGATCTTGAAAAGGGTTCTGTTTGTATTAGTGA CCAGTTCAACAGTGTTAACTTCTCTGAGGCTGAGGGTACTGAGGTAACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGA CAACCCTTTGTTAAATACGCCACGCTGATCAGCAACTCTAAACCAAGTGAAACTGGTGAAGAACAAGGGC TTATAAATAGTTCAGTCACCAAGTGCTTCTCTAGCAAAAATTCTCCGTTGAAGGATTCTTTCTCTAATAG CTCATGGGAGATAGAGGCCCAGGCATTTTTTATATTATCAGATCAGCATCCCAACATAATTTCACCACAC CTCACATTCTCAGAAGGATTGGATGAACTTTTGAAATTGGAGGGAAATTTCCCTGAAGAAAATAATGATA AAAAGTCTATCTATTATTTAGGGGTCACCTCAATCAAAAAGAGAGAGAGTGGTGTGCTTTTGACTGACAA GTCAAGGGTATCGTGCCCATTCCCAGCCCCCTGTTTATTCACGGACATCAGAGTTCTCCAGGACAGTTGC TCACACTTTGTAGAAAATAATATCAACTTAGGAACTTCTAGTAAGAAGACTTTTGCATCTTACATGCCTC AATTCCAAACTTGTTCTACTCAGACTCATAAGATCATGGAAAACAAGATGTGTGACCTAACTGTGTAA
Şekil 1: LEPR gen haritasında gene ait ilk exon bölgesinin gösterimi.
Ökaryotik hücrelerde yapılacak klonlama için ökaryotik özellikte ve insert' ün vektör içerisine yerleştiğinin anlaşılması amacıyla da reporter gen içeren vektör seçilmelidir. Amacımız füzyon proteini oluşturmak olduğu için de vektöre insert edilecek dizi, reporter gen bölgesinin dizisini bozmayacak şekilde (in-frame biçimde) reporter genin önüne veya arkasına yerleştirilmelidir.İnsert reporter genin önüne yerleştirilecekse (kullanılacak olan ve şekil 2 de gösterilen pGL2-Control vektörüne göre öyle olması gerekiyor) mRNA nın sentezlenebilmesi yani translasyonun-ekspresyonun gerçekleşebilmesi için insert ün 5' ucunda, transkripsiyonu doğru yerden başlatacak başlangıç kodonu (ATG) ve kozak dizisi olmalıdır. İnsert içinde stop kodonu veya poly A sinyali bulunması da mRNA sentezi sırasında tam sentez gerçekleşmeden (dizi tamamlanmadan) sentezi bitireceği için insert içinde bunların bulunmuyor olmasına dikkat edilmelidir.
Şekil 2 : Yapışkan uçlu ve düz uçlu klonlama deneylerinde kullanılacak olan vektör.
- Füzyon protein oluşturulabilmesi ve reporter genin özelliğinden yararlanılabilmesi için restriksiyon enzimlerinin kullanılması ve/veya insert ün yerleştirilmesi aşamalarının herhangi birinde reporter genin bütünlüğün bozulmamasına dikkat edilmelidir.
- pGL2-Control vektörü ökaryotik özellikte bir vektördür ve reporter gen özelliği gösteren antibiyotik (Ampisilin) direnç geni ve luciferase geni bulundurmaktadır. Tasarlanan füzyon proteininde füzyon proteini oluşturulurken insert ve luciferase genlerinin birleşiminden bir füzyon oluşturulması amaçlanmaktadır. Bu nedenle Luc+ proteininin düzgün biçimde ifade edilebilmesi için çerçeve kayması olmadan insert luc+ gen dizisinin önüne konulmalıdır.
- Kullanılan enzimlerin eksprese edilecek diziyi kesmemesine dikkat edilmelidir.
Şekil 3 : pGL2-Control vektörünün gen dizilimi üzerinde gen bölgeleri ve restriksiyon enzimlerinin kesim bölgelerinin gösterimi. 105 bazlık klonlanacak dizi:
5'ATGAGACAGCTGTTGAACCTAAGTTTAATTCAAGTGGTACTCACTTTTCTAACTTATCCAAAACAACTTTCCACTGT
TGCTTTCGGAGTGAGCAAGATAGAAACT
3'
Şekil
4 :
105 bazlık diziyi kesen enzimler ve dizi üzerindeki yerlerinin
haritası.
2. YAPIŞKAN UÇLU KLONLAMA
Şekil 4 te bulunan enzim haritasına ve vektöre bakılarak uygun, yapışkan uçlu ve restriksiyon enzimi seçilmelidir.Bu deney düzeneğinde oluşturulmak istenilen füzyon proteininin reporter gen önünde olması ve promotörden sonra ve polyA sinyali oluşturan gen bölgesinden önce olması amacıyla çoklu klonlama bölgesi yerine HindIII kesim bölgesi kullanılmıştır.İnsert ün gen bütünlüğünün korunması için klonlama için kullanılacak enzimin insert ü uç noktalarından başka bir yerden kesmiyor olması gerekmektedir. Eğer insert vektörden tekrar çıkarılıp kullanılmak isteniyorsa ya da kesilen plazmit parçalarının insert ün bütünlüğünü bozması engellenmek isteniyorsa kullanılacak resitriksiyon enziminin kesim bölgesinin vektör içerisinde olmamasına da dikkat edilmesi gerekmektedir. Buna göre;Homo sapiens Leptin reseptör (LEPR) geni üzerinden uygun primerler kullanılarak klonlanması istenilen gen bölgesi PCR ile çoğaltılır. Bu işlem sırasında hata payını en aza indirmek amacıyla Taq DNA Polimeraz yerine Pfu DNA Polimeraz enzimi kullanılmalıdır. Böylece mutant dizi oluşumu engellenmiş olur.Bu işlem sırasında kullanılan primerler HindIII kesim bölgesi oluşmasını sağlayacak şekilde mismatch ler yapılarak tasarlanmalıdır.HindIII enzimi ve kesim dizisi: A^AGCTT
Klonlanacak diziyi içeren gen bölgesi: (forward primer)
hindIII-
Kozak
dizisi
CCTTTTGCCTGCTGGACTCTCAAAGAATACTTCAAATtcGcaTGGACATTATGAGACAGCTGTTGAACCT AAGTTTAATTCAAGTGGTACTCACTTTTCTAACTTATCCAAAACAACTTTCCACTGTTGCTTTCGGAGTG AGCAAGATAGAAACTGCTCcTcgaaTGCAGACAACATTGAAGGAAAGACATTTGTTTCAACAGTAAATTC
TTTAGTTTTTCAACAAATAGATGCAAACTGGAACATACAGTGCTGGCTAAAAGGAGACTTAAAATTATTC
(reverse primer) *Mavi arka planlı olanlar HindIII kesim bölgeleri olarak belirlenmiştir ve bu alanlar içinde büyük harfle gösterilenler ise primerlerle birlikte değiştirilmesi gereken bazlardır. Kozak dizisi: ATTATGAG Kullanılacak primerler 1. Farward primer (mutant) : 5' CTTCAAATAAGCTTGGAC 3' Tm: 56,8 ºC orjinal dizi: 5' CTTCAAATTCGAATGGAC
Şekil 5 : Farward primerin oligo analizi. 2. Reverse primer (mutant): 5' GTTGTCTGCATTCGAAG 3' Tm: 58.9ºC
Şekil 6 : reverse primer ve oligo analizi
- Frame shift olmaması için 3’lü kodonlar olması sağlanmalıdır. 5' ucu kesim noktasından kayma olmaz. 3' ucunda da kesim noktasından öncesi ile klonlanacak 105 bazlık dizi arasında üçlü katlar şeklinde bazlar bulunduğundan klonlanacak dizi çerçeve kayması olmadan klonlanabilir, in frame yerleştirilir.
- Modifiye primerler tasarlanan inserte PCR uygulanır. PCR sırasında non-spesifik çoğalmış diziler olabilir, kontrol etmek ve saflaştırmak amaçlı olarak agaroz jelde yürütme işlemi uygulanır.
PCR
amplifikasyonu için ;
-negatif
kontrol
-Pfu
DNA Polimeraz
-Buffer
-dNTP
karışımı
-1,5
mM Mg++
-Forward
ve Reverse primerler
-Genomik
DNA
-Distile
su kullanılır.
- Hind III enzimiyle kesim plazmitin 239. bazından gerçekleştirilir. Bu kesim sonrasında tüp içerisine şekil 7 de gösterilen protokole uygun olarak CIP enzimi de eklenir.
- Kesim sonrası saflaştırma için tekrar alkol presipitasyonu yapılır. Plazmitin kesilip kesilmediği ve/veya tekrar birleşmelerin gerçekleşip gerçekleşmediğinin anlaşılabilmesi için agaroz jelde yürütme işlemi yapılır ve kesilen plazmitin lineer yapısından dolayı yavaş yürüyeceği blindiğinden bu özellik kullanılarak bir kontrol yapılır.
- Vektör aynı restriksiyon enzimiyle kesildiğinden 5’ ve 3’ uçların kendi üzerine yapışma ihtimali vardır. Bunu engellemek için vektörün 5’ ucu CIP’lenir. Plazmit Restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra oluşan yapışkan uçlar plazmitin iki ucunun birbirine yapışmasına yol açabilir. Plazmit kesildikten sonra tekrar yapışmasını engellemek için 5’ uçlarındaki fosfat kökleri CIP (calf intestine phosphatase) enzimi kullanılarak çıkarılabilir.
- Yapılan CIP uygulaması sayesinde 5' uçtaki fosfatlar kesileceğinden aynı enzimle iki ucu kesilen dizide ligaz enziminin 5’ ve 3’ uçların birleştirmesini sağlayacak fosfat grubu bulunmaz ve vektör kendi içinde tekrar birleşmez.
Şekil 7 : CIP uygulama protokolü - Vektörün doğru yerden kesilip kesilmediğini anlamak için agaroz jelde yürütme yapılır ve doğru kesilen vektör izole edilip kullanılır.
- Kesilen vektör ve insert aynı tüpe eklenir ve T4 DNA Ligaz enzimi ile ligasyon yapılır (T4 kinaz enzimiyle, 160C de gece boyu).
- Ligasyon agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilir. İnsert ve vektör ürünlerinin agaroz jelden izolasyonu sağlanır.
Şekil 8 : T4 DNA ligaz kullanım protokolü - Dizi analizi yapılırak kontrol edilir.Vektörün insert içerip içermediğine bakılır.
- CaCI yöntemiyle kompetan hücreler hazırlanır. Transformasyon gerçekleştirilir. Bu işlemlerde uygulanması gereken protokol aşağıdaki gibidir.Kompetant Hücre Hazırlanması
1.
37°C’de gece boyu büyütülmüş kültürden tek koloni seçilir.
2.
1L’lik erlenmeyer şişesinin içine 100ml LB besiyeri aktarılır.
3.
37°C’de 3 saat çalkalayıcı inkübatörde hücreler büyütülür.
4.
Kültürün büyümesi her 20 dakikada bir 600nm’de absorbansı
ölçülerek kontrol edilir.
5.
Hücreler, steril ve soğuk propilen tüplere aktarılır ve 10
dakika boyunca buzda bekletilir.
6.
4000rpm’de, 10 dakika boyunca 4°C sıcaklıkta santrifüjlenir.
Süpernatant dökülür.
7.
Her pelet, 2ml buz soğukluğunda 0.1M CaCl2 içinde çözülür ve
bir tüpte toplanır. Buz
içinde
bekletilir.
8.
4000rpm’de, 10 dakika boyunca 4°C sıcaklıkta santrifüjlenir.
Süpernatant dökülür.
9.
Peletler, 10ml’lik her kültür için 1,2ml olacak şekilde buz
soğukluğunda 0.1M CaCl2 +
%15
gliserolde çözülür.
10.
Elde edilen bakteri süspansiyonu 100µl lik alikotlar halinde
eppendorf tüplere aktarılır.
11.
Bu tüpler -80°C’lik dondurucuda saklanır.
Transformasyon
1.
Daha önceden CaCl2 yöntemiyle kompetan hale getirilmiş ve -80°C’de
saklanan 100µL bakteri stoğu 10 dakika buzda bekletilir.
2.
10 dakika sonunda buzda erimiş olan kompetan bakterilerin üzerine
1ng plasmid DNA’sı eklenir ve 30 dakika daha buzda bekletilir.
3.
Bakteriler buzdan alınıp 90 saniye boyunca sıcaklığı 42°C’de
sabitlenmiş ısı bloğunda ya da su banyosunda inkübe edilir.
4.
42°C’den alınan bakteriler 5 dakika buzda bekletilir.
5.
Daha sonra bakterilerin üzerine 900µL önceden 37°C’de inkübe
edilmiş LB (ya da SOC) sıvı besiyeri eklenir ve nazikçe pipetleme
yapılarak bakterilerin sıvı besiyerinde
dağılmaları
sağlanır.
6.
Hücreler 37°C’de 1 saat inkübe edilir.
7.
İnkübatörden alınan hücreler 14000 rpm’de 1 dakika
santrifüjlenerek çöktürülür. 8. Çökmüş hücrelerin
üzerinden 900µL süpernatant mikropipetle çekilip atılır. Pelet
olarak
çökmüş
hücreler, tüpün içinde kalan 100µL besiyerinde resüspanse
edilir.
9.
Bakteriler, plazmidin dirençlilik genini taşıdığı antibiyotiği
içeren LB agar plaklara ekilir ve 37°C’de gece boyu inkübe
edilir.
10.Bir
sonraki gün, transforme olmuş bakteri hücreleri plazmiddeki
antibiyotiğe dirençlilik genini taşıdıkları için
antibiyotikli agar plakta koloni oluşturabileceklerdir. Dolayısıyla
agarda büyümüş koloniler başarıyla trasforme edilebilen
bakterilerdir.
DÜZ
UÇLU KLONLAMA:
CCTTTTGCCTGCTGGACTCTCAAAGAATACTTCAAATTCGAATGGACATTATGAGACAGCTGTTGAACCT AAGTTTAATTCAAGTGGTACTCACTTTTCTAACTTATCCAAAACAACTTTCCACTGTTGCTTTCGGAGTG AGCAAGATAGAAACTGCTCCTTATGTGCAGACAACATTGAAGGAAAGACATTTGTTTCAACAGTAAATTC Mutant dizi: SacI CCTTTTGCCTGCTGGACTCTCAAAGAATACTTCGAGCT/CGAATGGACATTATGAGACAGCTGTTGAACCT AAGTTTAATTCAAGTGGTACTCACTTTTCTAACTTATCCAAAACAACTTTCCACTGTTGCTTTCGGAGTG AGCAAGATAGAAACTGCTCCTTATGAGCTCACAACATTGAAGGAAAGACATTTGTTTCAACAGTAAATTC SacI
Kullanılan
enzim ve kesim bölgesi
sacI:
5' GAGCT/C 3'
3'
G/AGCTC 5'
Forward
Primer: 5' AGA ATA CTT CGA GCT/ CGA 3'
Tm:
60,6ºC
Şekil 9 : Küt uçlu klonlama için hazırlanan forward
primer.
Reverse
Primer: 5' GTTGTGAGCTCATAAGGAG 3' Tm:
60,4ºC
Şekil 10 : Küt uçlu klonlama için hazırlanan reverse primer.
İnsan
genom DNA sına ait leptin geninin klonlama gözlenecek ilk mRNA
bölgesinin klonlanması aşamasında iki türlü klonlama prosesi
için gerekli bilgiler yukarıda verilmiştir. Yapışkan uçlu için
gerekli prosesler küt uçlu için de geçerlidir. Fakat küt uçlu
klonlama yapılırken CIP enzimine gerek yoktur. Çünkü küt uçlu
klonlama da kesilen plazmit uçları tekrar birbiri üzerine yapışıp
sirküler hale gelmezler. Bunun dışında bütün ligasyon,
elektroforez ve PCR protokolleri benzerdir.
Oluşan
füzyon proteinleri iki türlü klonlama içinde luc geni önüne
konulmuştur. Bu durum petrilerde lusüferaz aktivitesi gile birlikte
transformasyonu yapılan dizininde aktivitesinin olduğunu gösterir.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder