RANDOMLY AMPLİFİED POLYMORFİC DNA ANALİZİ

GİRİŞ:

Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA tekniği olan RADP tekniği, genetik polimorfizmin araştırılma teknikleirnden biridir. Genomla ilgili dizi analizi gibi herhangi bir ön bilgi tekniğine dayanmadan yapılan ve ucuz bir yöntem olan PCR tekniğine dayandığı için avantajlı bir yöntemdir. PCR metoduna dayalı bu teknikte rastgele seçilmiş kısa oligonükleotid primerler kullanılarak DNA üzerinde rastgele parçalar çoğaltılır ve çoğaltılan parça sayısı ve çeşidine göre türler arasında polimorfizm bilgisi elde edilir. RADP tekniğinin bu özelliği filogenetik araştırmalarda çok sık kullanılmakradır. Örneklerin hepsinde bulunan RADP bantları monomorfik olarak kabul edilmektedir. Bazı bireylerde bulunmayanlar veya değişken mobiliteye sahip olanlar ise polimorfik olarak kabul edilmektedir. Elde edilen bantlar, yapılan genetik analizlerde yardımcı olmaktadırlar.

Şekil 1: Touchdown PCR ın çalışma prensibi

AMAÇ:

MATERYALLER:

Cihazlar:

Techne TC312 Thermal Cycler PCR cihazı

UV görüntüleme cihazı (Biorad)

Elektroforez güç kaynağı (Thermo Electron Corporation, EC 250-90)

Laboratuvar Gereçleri:

0,2 ml PCR tüpü

Sarı uç

Beyaz uç

Eldiven

Parafilm

Atık kabı

%1,5'lik agaroz jel (Prona)

Tüplük

Mikropipet seti

Kimyasallar

Taq (5U/µl, Fermentas )

10X PCR tampon çözeltisi (Fermentas)

MgCI₂ (25 mM)

25 mM Primer (OPF-1 7, OPF-0 6, OPJ- =8, OPK-1 1, OPF-1 3, Macrogen)

dNTP mix ( Herbiri 10 mM)

ddH₂O

100 bp Marker (Fermentas)

Yükleme tamponu (Thermo 6X DNA Loading Dye;10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene

cyanol FF,60% glycerol, 60 mM EDTA içeren, -20ºC de muhafaza edilmiş ve riskli bileşen içermeyen)

YÖNTEM:

• 5 tüplük master mix hazırlamak için mikropipet seti kullanılarak 12.5 ul 10X buffer çözeltisi, 7.5 ul MgCI₂ , 2 ul dNTPmix, 95 ul ddH₂O, 2 ul primer ve son olarak da 1 ul Taq DNA polimeraz enzimi master mix hazırlanacak olan PCR tüpüne eklendi.
• 4 ayrı DNA tüpüne 4 farklı balık türünden izole edilen DNA lardan 1 er ul eklendi ve üzerlerine 24 er ul master mix eklendi.
• İçerisinde DNA bulunan ve isimlendirilen 4 PCR tüpü ve DNA eklenmeyen kontrol tüpü Techne TC312 thermal cycler PCR cihazına konuldu ve PCR protokolü

94ºC da 5 dk ve 1 kez

94ºCde 30 sn,

30ºC de 1 dk,

70ºC de 2dk lik 35 çevrim olacak şekilde ve

,

72ºC de 5 dk lik 1 çevrim olacak şekilde

72ºC de 5 dk da 1 defa olarak ayarlandı.

• PCR sonrasında alınan tüpler 1 ul DNA yükleme boyası ve 5 ul DNA örneği alınarak parafilm üzerinde pipetleme yöntemiyle karıştırıldı ve önceden hazırlanmış %1,5' lik agaroz jele yüklendi.
• 100 bp lik marker da jele aynı şekilde yüklendi.
• Örnekler elektroforez cihazında güç kaynağı 120 V'a ayarlanmış şekilde 15 dakika yürütüldü.
• Elektroforez sonrasında jel, UV görüntüleme cihazıyla görüntülendi.

BULGULAR:

• 4 farklı türde balıktan izole edilen DNA örnekleri ve OPF-1 7 primeriyle yapılan PCR sonucu elde edilen jel görüntüsü şekil 2 deki gibi görüntülenmiştir.

Şekil 2: 4 farklı DNA örnekle yapılan tüplerin PCR görüntüleri

TARTIŞMA:

Master mix hazırlanarak küçük hacim hataları engellenmeye çalışıldığı halde jeldeki örneklerin büyük bir kısmından görüntü alınamamıştır. Jele yüklenen marker ve DNA larla birlikte yüklenen boyaların yürüdüğü görüntülendiği için pipetleme hatalarının yapıldığı ve elektroforez sisteminindüzgün çalıştırılmadığı da söylenemeyeceği içinde PCR için kullanılan bileşenlerin bu duruma sebep olduğu şeklinde yorum yapılmalıdır.

Bütün grupların kullandıkları primer birbirinden farklıdır ve her grup birbirinden farklı, aynı 4 DNA örneğiyle PCR sistemi tasarlamıştır. Bu durumda içerisinde DNA örneği bulunan her tüpün farklı 4 farklı DNA örneği ve 5 farklı primerin farklı ikili kombinasyonlarıyla oluşturulduğu bilindiği için bant gözlemlenen kuyucuklardaki primerlerin o kuyucuktaki DNA örneği için spesifik bağlanma bölgesi olduğu söylenebilir.

Birinci grubun birinci tüpü içerisinde bulunan DNA 1 ve OPF- 1 7 primeri ile yapılan PCR da tek ve büyük bir bant oluşumu gözlemlenmiştir. Bu durum DNA 1 örneği için kullanılan primerin DNA ya spesifik bir bölgeye bağlandığını ve PCR ın gerçekleştiğini gösterir. Fakat diğer 3 DNA örneği için bu primerin bağlanma bölgesi olmadığı söylenebilir.

Beşinci grubun gerçekleştirdiği PCR için 3. ve 4. kuyucuklarda bulunan OPF-1 3 primeri ve o tüplerde bulunan DNA örnekleri için bu şartlarda bağlanabildikleri ve PCR ın gerçekleştiği söylenebilir. Bu iki kuyucukta da iki bant gözlemlenmiştir. Biri 400 diğeri 700 bp lerde gözlemlenen bu bantlarla ilgili olarak DNA örneğinin heterozigot olduğu söylenebilir. Çünkü aynı prob kullanılmasına rağmen farklı iki bant gözlemlenmiştir.

Bu deneyde yapılan RAPD analizi, tür analizi yapmaktan ziyade PCR şartalarının değerlendirilmesi amacıyla yapılmıştır. Jelde incelenen görüntülerin PCR koşullarına göre değerlendirilebilmesi için yapılan RADP tekniğinde non-spesifik bağlanma olasılıklarının arttırılması gerekmektedir. Non-spesifik bağlanmaların artttırılabilmesi için deney tüplerine eklenen primer miktarları arttırılabilir. Primerlerin arttırılmasıyla birlikte magnezyum miktarı da arttırılabilir. Böylece eklenen primerlerin DNA bölgeleri üzerinde bağlandıkları non-spesifik bölgeler arttırılabilir. Magnezyum miktarının arttırılmasıyla birlikte de enzim aktivitesi artacağı için, primer miktarının arttırılmasıyla yine non-spesifik bağlanmalar arttırılabilir.

REFERANSLAR:

• Ochman, H., A.S. Gerber and D.L. Hartl. 1988, Genetic application of an inverse polymerase chain reaction, Genetics, 120:621
• DEVRİM, Aplarslan K, KAYA Necati, RAPD Tekniği ve Biyokimya Alanında Kullanımı, Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi (2006), 12 (1), pg: 97-101, Yayın kodu: 2005/22-D
• İnnis MA, Gelfand HD, Skinsky JJ: PCR Strategiest. Academic Press. 39-67, San Diego, 1989