KROMOZOMAL HASTALIKLAR

Kromozomlar, çok düzenli olarak, kendi üstüne sarmallanmış devasa DNA molekülleridir. Bu moleküllerin dizilmesindeki en ufak bir hata, hücrelerin bölünmesini engelleyebiliyor. 46 kromozoma dağılmış olan DNA’nın iki omurgasını oluşturan 3 milyar 200 milyon baz var. Her gen ,yaşamın olmazsa olmaz işlevlerini yerine getirmek üzere, hücrelere gerekli komutları veren 10-20 bin bazdan oluşuyor. 

DNA şeridinin büyük kısmı çöp DNA olarak değerlendiriliyor. Bu iş görmeyen bu kısım,genleri bir bobin gibi sarmallayarak, onların DNA kopyalaması sırasında kırılmaları önlemektedirler.İnsanlığın geleceğinin yazılı bulunduğu kromozomlar bizlerin kimlik kartlarını olusturur.Her bir kromozonun üzerinde hangi gen setlerinin bulunduğu ve işlevleri üzerindeki çalışmalar yeni yeni bilgiler vermekte.İnsanın hangi hastalıklara yakalanabileceği,ne kadar uzun yaşayacağı,zeka kapasi,korkaklık,saldırganlık gibi tüm özelliklerin belirlendiği emir kipleridir kromozomlar.Aşağıda bu kromozomlarda meydana gelebilecek bozuklukların yol açabileceği bazı hastalıklar ve kromozomun etkileri belirtiliyor.

1.Kromozom:En büyük kromozom...Alzheimer hastalığı,prostat kanserine eğilim,baskın sağırlık,doğuştan katarak,Rh faktörü,akciğer kanserine yatkınlık

2.Kromozom:Sık görülen birçok hastalığa neden oluyor.belleğin oluşumuyla ilgili bilgiler,kolon(kalın bağırsak) kanseri,kas gelişimini engelleyen gen,doğuştan gece körlüğü,2 tip şeker hastalığı.

3.Kromozom:Cinsel yaşam için çok önemli bir kromozom.kolon kanseri,obezite(ciddi şişmanlık),şizofreniye yatkınlık,doğuştan ilerleyici olmayan gece körlüğü.

4.Kromozom:Cücelik(akondroplazi),huntington koresi(40 yaşından sonra titremeleri izleyen bunama),baskın sağırlık,diabet,alkol bağımlılığına eğilim,manik depresif psikoz,sedef hastalığı,parkinson hastalığı.

5.Kromozom:Duygusal zekaya ilişkin kromozom.Dikkat kusuru,Akne,saç dökülmesi,ilerleyici işitme kaybı

6. kromozom: Şizofreniye eğilim,bağışıklık sistemi ,disleksiye yatkınlık,kroner damar sertliği,epilepsi

7.Kromozom: Kolon kanseri,sinir sistemi tümörü,otizm(içedönüklük),şizofreniye yatkınlık,kronik akciğer iltahabı,şişmanlık

 8.Kromozom: Erken sara,Werner hastalığı(çocuğun erken yaşlanması),kalıtsal kellik,şizofreniye yatkınlık,genel saraya yatkınlık,guart

9. Kromozom:kötü huylu deri kanseri,galaktozemi (çocukta sütü sindirememe durumu),hirsutizm(aşırı kıllanma),ABO kan sistemi

10.Kromozom:Yarık dudak damak,işitsel belirtilerle kısmi sara,vitiligo(deride bölgesel pigment yokluğu),obezite,retinanın atrofisi

11.Kromozom:Diyabet,Hemoglobin hastalığı),drepanositoz(kan hastalığı),manik depresif psikoz,kalp aritmisi,iris tabakası yoğunluğu

12.Kromozom:İltihaplı bağırsak hastalıklarına yatkınlık,vitamine bağlı raşitizm(D vitamini metabolizmasında kusur),astım,alkol etkenli yüz kızarması,diabet

13.Kromozom:Baskın sağırlık,göğüs kanseri,retina kanseri(retinablastom),kalıtsal gece işemesi,erken meme kanseri(BRCA2 geni)

14.Kromozom:Alerjiye yatkınlık(egzama),Sağırlık(dil gelişiminden sonra),siroz,alzheimer

15.Kromozom:Doğuştan beyin özrü,Disleksiye eğilim,Marfan hastalığı(basketciler gibi uzun el ve ayak ile çok uzun boy),Kroner damar sertliği.

16.Kromozom:Manik depresif psikoz,hemoglobin hastalığı,katarak,iltahaplı bağırsak hastalığı(Crohn hastalığı),yüksek tansiyon

17.Kromozom:Meme kanserine eğilim(BCCR geni),Tüm kanserlere eğilim,ağır astım,yumurtalık kanserine eğilim(BRCA 1 geni),cücelik,sedef hastalığına yatkınlık,bunama,diabet

18.Kromozom:Manik depresif psikoz,erken obozite,kızıl saç,yüksek miyop,kolon kanseri.pankreas kanseri

19.Kromozom:Migren,baskın sağırlık,geç dönem alzheimer hastalığı,kroner damar sertliği,auralı ve beyin lezyonlu migren krizleri

20.Kromozom:Boy uzunluğu belirleyicisi,uykusuzluk,diabet,baskın gece sarası,birleşik bağışıklık yetmezliği

21.Kromozom:Alzheimer hastalığı,amyotrofik lateral skleroz(Stephen Hawking’in hastalığı),manik depresif psikoz,Down sendromu,ilerleyici miklonik sara,parkinson,lösemi.

22 Kromozom:doğumsal kalp hastalığı,Kedi gözü sendromu,Şizofreniye eğilim,otizm(içe dönüklük),zeka geriliği,glikoz ve galaktoz sindirim bozukluğu,kemik iliği oluşumunu düzenliyor

23.Kromozom(Y):Erkeklik cinsiyetini belirliyor,cinsel organların gelişimini düzenliyor.

24.Kromozom(X):İki adet kromozomu taşıyan bebek kız oluyor.Bu kromozomdaki dejenerasyon;kas erimesi ve cüceliğe yol açıyor.

ALZHEİMER'S DİSEASE

Alzheimer's Disease (AD), Yaşlılarda demansın en yaygın nedenidir. Hastalık, kademeli olarak ilerleyen bellek kaybı, dil ve dikkat sorunları gibi zihinsel fonksiyonlar ile klinik olarak karakterize edilir. Bunların yanı sıra, psikoz, depresyon, anksiyete ve ajitasyon yaygın olarak görünen semptomlardır (Cummings, 1995).

Alzheimer; hafıza, konuşma, yön bulma insanları tanıma, problem çözme gibi günlük yaşamda birçok kez gerçekleştirilen pratiklerin, çeşitli zihinsel işlevlerin zamanla zayıfladığı, günlük işleri yerine getirme yeteneğinin azaldığı ve davranış bozukluklarının görülebildiği ilerleyici bir beyin hastalığıdır.

Hastalık ismini Dr. Alois Alzheimer'den almaktadır. August D'yi ilk kez 1901'de muayene ettikten sonra onu, 8 Nisan 1906'da ölümüne kadar izlemiş ve nöropatolojik incelemesini yapmıştır.  4 Kasım 1906'da Tübingen'de yapılan “37. Güney-Batı Alman Psiyatristleri Kongresi”nde hastanın klinik tablosu ile patolojik bulgularını sunmuştur. Hastanın klinik öyküsü “ilerleyici bilişsel bozukluk, fokal semptomlar, hayal görmeler, paranoid hezeyanlar ve psikososyal yetmezlik gösteren 51 yaşında kadın hasta” olarak özetlenmiştir.

Hastalığın tanısı için kullanılan “senil plaklar, nörofibriler yumaklar, nöron ve sinaps kaybı, arterosklerotik değişiklikler” gibi patolojik bulgular, August D' nin otopsi incelemesi ile Dr. Alzheimer tarafından tanımlanmıştır. Dr. Alzheimer o günlerde yeni kullanılmaya başlanan Bielschowsky'nin gümüş boyama metodu ile preparatları incelemiştir.

Alzheimer ilk zamanlar “presenil” (65 yaş öncesi) yaş grubunda görülen ender bir hastalık olarak kabul edilse de bugün Alzheimer hastalığı yaşlılığın en sık görülen hastalığıdır ve bütün ölümlerin sıklığında da dördüncü sırayı almıştır.

Alzheimer hastalığının ana mekanizması, beyin hücrelerinde meydana gelen kaybolmanın nedeni henüz bilinmemekle beraber, hastalığın ortaya çıkmasındaki temel etkenlerinin

genetik faktörler,
anormal proteinlerin rolü,  
otoimmün reaksiyonlar,
toksik reaksiyonlar,
kafa travmaları ve
virüsler olduğu düşünülmektedir.
Bunların yanında esansiyel elementlerin ve serebral kan damarlarının rolü de önemli bulunmuştur.
Alzheimer dahil bütün demansların en önemli risk faktörü yaştır. Birçok araştırmada kadınlardaki  Alzheimer riski erkeklerden daha fazla bulunmuştur (yaklaşık iki kat).
Birinci derecede yakınlarında Alzheimer hastalığı olanlarda demans gelişme riski ortalama dört kat fazladır.
Ailesinde Down sendromu olanlarda da Alzheimer riski artmaktadır.(türkçebilgi?
Son yıllarda kolesterol taşınmasında görevli bir protein olan Apolipoprotein E e4 alleli taşıyanların birçoğunun hastalığa yatkın olduğu saptanmıştır.
Hipertansiyon, homosistein yüksekliği, atrial fibrilasyon, kolesterol yüksekliği, insilüne bağımlı diyabet hastalığı...
Aliminyuma maruz kalma
Kafa tramvası
Ateroskleroz

Alzheimer hastalığı bir yaşlılık hastalığıdır. Genellikle  60 yaşın üzerindeki kişilerde rastlanmaktadır. Nadiren 40'lı ve 50'li yaşlarda da görülebilir. Son yıllarda yapılan araştırmalarda cinsiyet farkı olmaksızın 65 yaş üzerindekiyaşlıların % 10’unda, 80 yaş üzerindekilerin % 22’sinde Alzheimer hastalığının görüldüğü saptanmıştır.

Olguların yüzde 90’ı 65 yaşın üzerinde ve sporadik olarak ortaya çıkar (Geç-Başlangıçlı AH, GBAH). Ancak hastalığın etiyolojisinde genetik faktörlerin etken olduğuna dair yeterince kanıt vardır. Bugüne kadar mutasyona uğradıklarında otozomal baskın seyreden, erken-başlangıçlı AH’ye (EBAH) neden olan üç gen tanımlanmıştır (β-Amiloid Prekörsır Protein (APP), Presenilin 1 ve Presenilin 2 ) (Yokeş, 2007).

65 yaş öncesinde hastalığın oluşması durumunda hastalık earyl onset AD (EOAD) veya ''presenilin'' olarak isimlendirilirken 65 yaş ve üzerinde hastalık oluşması durumunda late onset AD (LOAD) veya ''senilin'' olarak isimlendirilir. Bu iki durum arasında patolojik bir fark yoktur.

Hastalığın prelevansı yaşla birlikte artar.  60-64 arasında yüzde birden az, 65-74 arasında %7-10, 85 ve üzerinde %40(Breteler et al., 1992; Hebert et al., 2003).

Türkiye'de yaşlı nüfus oranında gözlenen artış (WHO, 1998)

ALZHEİMER SEMPTOMLARI:

Demans - Davranıssal ve Psikolojik Semptomlar (DDPS)
Demans hastalarında görülen Davranışsal ve Psikolojik semptomlar, algı, düşünce içeriği, duygu durum belirti ve semptomlarına denir. Bu semptomlar asağıdaki gibi sınıflandırılabilir. (Alzheimer Vakfı)

Davranışsal semptomlar                            
Agresyon
Amaçsız gezinme
Uygunsuz yeme davranışı
Uygunsuz seksüel davranış

Psikolojik Semptomlar
Depresyon
Anksiyete
Hezeyanlar
Halusinasyonlar
Uykusuzluk
Hatalı tanımlama
Hatalı yorumlama



Patolojik semptomlar
Alzheimer hastalığı olan bir beyinde nörofibriler düğümler ve senil plaklarda ağır patolojik bulgular gözlenir. Ayrıca özellikle temporal, perietal ve entorhinal kortekslerde olmak üzere hipokampüs ve amigdalada ağır nöronal ve dentrik kayıplar vardır (McKhann et al., 1984). Sonuç olarak kolin transferaz enziminin aktivitesinde azalma olur (Mirra et al., 1991). Bu azalmada  lateral serebral ventriküllerin  kortikal incelme ve genişlemesine sebep olur.

Fiziksel değişiklikler

ALZHEİMER HASTALIĞININ MOLEKÜLER PATOLOJİSİ

β-Amiloid Plaklar

Patolojik bulguların başında senil plaklar gelir. Bu plakların ana maddesi 4kDa büyüklüğündeki  beta-amiloid peptididir(Aβ).  Aβ peptidleri, 39-43 aa uzunluğunda (çoğunlukla 40-42), beta amiloid prekörsır proteininin (APP) proteolitik yıkımı sonucunda oluşan ürünlerdir (Glenner ve diğ., 1984).
Sağlıklı hücreler tarafından da salgılanırlar ve plazma ve serebrospinal sıvılarda bulunurlar. Sağlıklı bireylerde tüm  Aβ peptidlerinin %90’ını  Aβ40  peptidleri oluşturur ( Aβ42 ye gore daha fazla miktarda).

Alzheimer hastalarının beyinlerinde Aβ peptidleri 8 nm capında hücre-dışı filamentler oluşturur. Bu filamentlerin birikmesi senil plaklara ve 10-100 μm çapında hücre-dışı  lezyonlara neden olur. Senil plaklar çoğunlukla hippokampus ve temporal kortekste görülür.
Hücre kültürü deneylerinde Aβ peptidlerinin
nörit büyümesini hızlandırdığı,
 reaktif oksijen moleküllerini arttırarak sitotoksik oksidatif strese yol açtığı,
 mikrogliyal hücreleri aktive ettiği ve
Ca2+ metabolizmasını bozduğu görülmüştür. Nöronlar üzerinde doğrudan toksik etkisi olduğu kabul edilse de,  Aβ agregatlarının mı AH’ ye yol actığı, yoksa AH sonucunda mı senil plakların oluştuğu henüz bilinmemektedir.

Nörofibriler yumaklar:

Hücre iskeletinin ana bileşenleri nörofilamnetler (yapısal destek oluşlturarak aksonal ve dendritik büyüme) ve mikrotübüllerdir (hücre içinde madde transportu). Mikrotübüler sistemin ana maddesi Tau proteinidir ve Alzheimer hastası beyinde bu proteinin hiperfofsforile olduğu görülmüştür. Bu durumdaki Tau proteini mikrotübüllere bağlanamayacağı için parçalanır. Fosforilleneme bağlı olarak parçalanan mikrotübüler sistem Tau proteini açısından zengin nörofibriler yumaklara dönüşür.

Tau geni, 17, kromozomda bulunur, 55-110 kDa büyüklüğündedir, yetişkin insan beyninde yaklaşık 6 farklı izoformu bulunur. Nöron icinde, akzonlarda ve dendritlerde oluşan nörofibriler yumaklar, protein sentezini ve organellerin işlevlerini bozarak hücrenin ölümüne neden olurlar.

Son incelemeler, nörofibriler yumak yokluğunun Aβ plak yokluğuna oranla hastalık semptomlarıyla daha fazla ilişkili olduğunu göstermektedir. Araştırmacılar Baptist (Aβ agregasyonunun hastalık nedeni olduğunu düşünenler) ve Tuaist (Tau agregasyonunun hastalığın asıl nedeni olduğunu düşünenler) olmak üzere ikiye ayrılmasına neden olmuştur. Son yıllardaki bulgular amiloid hipotezini daha çok desteklemektedir: APP geni üzerindeki mutasyonlar AH’ye neden olurken, Tau mutasyonları FTDP-17’ye (nörofibriler yumaklar görülmesine rağmen Aβ plaklarına hiç rastlanmaması) yol açmaktadır (Cruts ve diğ., 2004).

Nörofibriler yumaklarının Aβ metabolizdaki değişiklikten sonra oluştuğu düşünülmektedir. Özellikle EOAD durumuna neden olan presenilin geni mutasyonlarının Aβ42 / Aβ40 oranını arttırıp fazla Aβ42 nin çökmesine sebep olduğu düşünülmektedir.  Aβ peptidlerinin Tau fosforilizasyonuna neden olabilecek mekanizmaları harekete gecirebileceği gözlenmiştir; fibriler Aβ peptidlerine maruz kalan hippokampal hücrelerde MAPK ve GSK3β yolakları aktive olmakta ve Tau hiperfosforilizasyonu olşmaktadır.(Ferreira ve diğ., 1997, Hoshi ve diğ., 2003).

Oluşumunun genellikle sporadik olduğu gözlemlenen Alzheimer hastalığının genetik alt yapısının olduğunu gösteren de pek çok kanıt vardır. Bazı vakalarda açık olmasa da hastalığın otozomal dominant olarak kalıtıldığı söylenebilir.

Hastalığa neden olan birçok yolak tanımlanmıştır ve bnu yolakların çok büyük bir kısmı mutasyona uğrayan ve Alzheimer ile ilişkili üç gen üzerinden hastalığa neden olduğu bilinmektedir. β-amiloid prekörsır protein (APP), Presenilin 1 (PS1) ve Presenilin 2 (PS2) genleri. Bu genlerin kodlayıcı bölgelerinde oluşan mutasyonlar EOAD oluşturmaya yeterlidir. PS1 mutasyonları en sık görülenidir ve ailesel EOAD olgularının %18-50’sini oluşturur. APP (%5) ve PS2 mutasyonlar› (<%1) daha seyrektir. Bu üç gene bağlı  mutasyonlar tüm Alzheimer olgularının %2-10’ unu kapsar (Hutton ve diğ., 1996).

Günümüze kadar hiçbir LOAD olgusunda APP, PS1 ve PS2 genlerinde kodlayıcı bölgelerde mutasyon gözlemlenmemiştir. Bu nedenle  LOAD için genetik ve çevresel etkili fakat kalıtım türü belli değil yorumu yapılabilir.

Bu genler içerisinde
EOAD ye neden olan genler
β-amiloid Prekors›r Protein Geni
Presenilin genleri (PS1 ve PS2)
LOAD ye neden olan genetik risk faktörleri
OPAE geni
Promotor polimorfizmleri
Kromozom 10q
Kromozom 6q21
Kromozom 11q23
Kromozom 12p13 ve 12q13
Genom tarama çalışmaları

β-amiloid Prekörsır Protein Geni:

21. kromozomda uzun kolda bulunan, hücre zarında bulunan APP benzeri protein ailesinin evrimsel olarak korunmuş üyesidir.
APP proteini sekretaz enzimleri tarafından yıkıma uğrar. N-terminal ucu parçalanıp hücre dışına salınır ve C-terminal ucu hücre içinde nonamiloidogenik ve amiloidogenik olarak isimlendirilen ve birbiriyle yarışan iki mekanizma ile metobolize edilir.
Bu yıkımla birlikte  sonucunda Aβ peptidleri oluşabilir. Mekanizması tam olarak açığa kavuşturulamayn sekretaz enzim grubunun üç türü olduğu bilinmektedir.

PS1 ve PS2 Genleri:

Tüm canlı türlerinde homologları bulunur ve evrimsel olarak korunmuştur. PS1 ve PS2 arasındaki benzerlik oranı %67 dir. Transmemran domainleri arasında bu benzerlik %95 e ulaşır.
PS1 peiferal dokuda ve sinir sisteminde sentezlenir.
PS1 in nöronal farklılaşma, gelişme ve sinaptik işlevlerde rol oynadığı düşünümektedir.
Bugüne kadar 142 PS1 mutasyonu tanımlanmıştır. Bunlar yanlış anlamlı mutasyonlardır. Protein sentezini engelleyen ya da protein yapısını etkili bir şekilde değiştiren bir delesyon ya da inversiyona rastalanmaması PS1' in hayati bir öneme sahip olduğunun kanıtıdır.
PS2 mutasyonlarının Alzheimer in oluşumundaki rolü henüz tam olarak açıklanamamıştır.

APOE geni:

Apolipoprotein E geni (APOE) 19. kromozomda (19q13.2) lokalizedir.
Birçok dokuda bulunur, en aktif olduğu organ karaciğerdir.
Lipoproteinlerle etkileşime girer ve yıkımlarını yönlendirir. Kolestrol ve trigliserit transportunda görevlidir.
Kan-beyin bariyerini geçemez, beyinde astrositlerce sentezlenir. Beyinde en fazla miktarda bulunan apoproteindir. Periferik ve merkezi sinir sistemi hasarından sonra miktarında artık olması nöron rejenerasyonunda  rol oynadığını düşündürmektedir.
APOE4 olarak isimlendirilen genotipinin nöropatolojik fenotipi Aβ agregasyonunda artış görümüştür. Beyindeki amiloid düeylerinin nasıl etkilediğine dair iki farklı hipotez vardır.

Genom Tarama Çalışmaları:

Hastalığa açıklık getirebilmek için birçok laboratuvar tarafından tüm genomu içeren analizler yapılmaktadır.
Bu çalışmalar hastalığın tam mekanizmasını açıklamaktan çok hastalığın ne kadar kompleks bir yapıda olduğunu göstermektedir.
Buna rağmen hastalığa neden olabilecek bazı kromozom bantları ve bölgeleri gösterilmiştir.
Bazı bulguların birden fazla laboratuvar tarafından gösterilmiş olması hastalığın etkeni olan gen bölgesi ve  tam mekanizmasının aydınlatılması yoluna ışık tutmaktadır.

REFERANSLAR:

Cummings JL. Dementia: the failing brain. Lancet. 345:1481-1489, 1995.

Yokeş MB. Molecular genetics of Alzheimer's Disease. Journel of Cell and Molecular Biology. 6 (2): 73-97, 2007.

Yadong Huang and Lennart Mucke. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148 (6): 1204–1222, 2012.

Ashe KH, Zahs KR. Probing the biology of Alzheimer’s disease in mice. Neuron. 2010; 66:631–645. [PubMed: 20547123]

Petersen RC, Aisen PS, Beckett LA, Donohue MC, Gamst AC, Harvey DJ, et al. Alzheimer’s disease neuroimaging initiative (ADNI): clinical characterization. Neurology. 2010;74:201–209.

Shoji M, Matsubara E, Murakami T, Manabe Y, Abe K, Kanai M, et al. Cerebrospinal fluid tau in dementia disorders: a large scale multicenter study by a Japanese study group. Neurobiol Aging. 2002;23:363–370.

Glenner GG, Wong CW. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochemical And Biophysical Research Comunications 1984;120:885-890.

Cruts M, Rademakers R. AD and FTD Mutation database, 2004, http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations/
Ferreira A, Lu Q, Orecchio L, Kosik KS. Selective phosphorylation of adult tau isoforms in mature hippocampal neurons exposed to fibrillar A beta. Molecular and Cellular Neurosciences 1997;9:220-34.

Hoshi M, Sato M, Matsumoto S, Noguchi A, Yasutake K, YoshidaN, Sato, K. Spherical aggregates of {beta}-amyloid(amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau proteinkinase I/glycogen synthase kinase-3{beta}. Proceedings ofNational Academy of Sciences USA 2003;100:6370-5.

Hutton M, Busfield F, Wragg M, Crook R. Perez-Tur J, Clark RF, Prihar C, Talbot C, Phillips H, Wright K, Baker M, Lendon C, Duff K, Martinez A, Houlden H, Nichols A, Karran E, Roberts C, Venter JC, Adams MD, Cline RI, Phillips CA, Fuldner RA, Hardy J. Goate A. Complete analysis of the presenilin 1 gene in families with early onset Alzheimer’s disease. Neuroreport 1996;7:801-805.

Ballatore C, Lee VMY, Trojanowski JQ. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer’s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 2007; 8:663–672. [PubMed: 17684513

McKhann G, Drachman D, Foistein M. Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease. Neurology. 34:39-44, 1984.].

Mirra SS, Heyman A, McKeel D. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41:479-486, 1991.

Breteler MMB, Claus JJ, Van Dujin CM. Epidemiology of Alzheimer's Disease. Epidemiology Review. 14:59-82, 1992.

Hebert LE, Scherr PA, Bienias JL, Bennett DA, prevalence estimates using the 2000 census. Archives of Neurology. 60:1119-22, 2003.

https://www.zillner.com/insights/alzheimers-dementia/ (21.04.2013)

TEŞEKKÜRLER...

TRANSFORM TOP10 KÜLTÜRÜ EKİMİ

GİRİŞ:

Lysogeny broth (LB) Medium: Besin değeri zengin bir bakteri büyüme ortamıdır. Giuseppe Bertani tarafından oluşturulmuştur. Escherichia coli ekimi için bir standardizasyonu geliştirilmiş ve endüstriyel üretimi yapılmaya başlanmıştır. Şekil 1 deki gibi renk ve görünümde olan besiyerinin farklı formülasyonları bulunmaktadır ama içerisinde genel olarak büyümeyi teşvik etmek için kullanılan

Peptitler ve kazein peptonlar

Vitaminler (B vitaminleri dahil)

Eser elementler (örneğin azot, kükürt, magnezyum)

Mineraller

Peptitler ve peptonlar tripton bulunmaktadır.

YÖNTEM

• Gece boyunca inkübe edilmiş TOP10 hücre kültüründen mikropipet yardımıyla 40ul alınarak içerisinde 15 ml SOB bulunan falkona aşılama yapıldı.
• Hemen ardından falkondan 20 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 180ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
• Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diğer elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
• Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
• Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
• İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
• Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 4 defa daha tekrar edildi.
• Shaker dan çıkarılan falkondan 2 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 198ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
• Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
• Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
• Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
• İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
• Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 3 defa daha tekrar edildi.
• Tekrar shaker dan çıkarılan falkondan 1 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 999ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
• Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
• Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
• Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
• Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
• Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
• Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
• İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
• Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 3 defa daha tekrar edildi.
• Ekim yapılan plate'ler 37ºC deki etüve konuldu.
• Yaklaşık 24 saat sonra plate'lerde üremiş olan bakteri kolonilerinin sayımı yapıldı.

BULGULAR

• Besiyerine ekildikten yaklaşık 24 saat sonra besiyerinde üreyen bakteri kolonileirnin plate'lerdeki görünümü Şekil 2 deki gibidir.

Şekil 2 : LB-Agar besiyerinde 24 saatlik inkübasyondan sonra plate'lerin görünümü

• Ekim yapılan her koşulda hazırlanan dilüsyon oranlarındaki örneklerin 560 nm deki OD değerleri tablo 1 deki gibi bulunmuştur. Her 30 dk lık zaman dilimi için yapılan 3 ayrı dilüsyonun aritmetik ortalaması alınmıştır. Ortalamanın alınma şekli:

0. dakika için; (0,09 +0,08+0,09) / 3 = 0,086

Tablo 1: Örneklerin 560 nm'deki Absorbans değerleri

Deney Süresi (dk)	%10'lik dilüsyon	%1'lik dilüsyon	%0.1'lik dilüsyon	Ortalama OD
0	0,09	0,08	0,09	0,09
30	0,09	0,09	0,09	0,09
60	0,11	0,08	0,08	0,09
90	0,09	0,1	0,11	0,1
120	0,09	0,08	0,08	0,08
150	0,1	0,09	0,11	0,1
180	0,14	0,08	0,08	0,1
210	0,17	0,11	0,1	0,13
240	0,13	0,1	0,08	0,1
270	0,21	0,09	0,11	0,14

• Belirlenen ortalama değerlere göre OD değerlerinin zamana bağlı değişimini gösteren
  grafik şekil 3 teki gibi bulunmuştur

• Yapılan ekimlerde dilüsyon oranslarına göre inkübasyondan sonra yapılan koloni sayımlarının sonuçları ve her zaman aralığında yapılan üç ekimin ortalama koloni sayısı değeri tablo 2 deki gibidir.

Tablo 2 : Plate'lerde oluşan koloni sayıları

Deney süresi (dk)	Koloni sayısı
I.ekim	10-2	10-3	10-4
0	736	3936	900
30	896	1280	680
60	808	1360	204
90	5120	2112	872
II.ekim	10-3	10-4	10-5
120	2096	144	24
150	2288	504	42
180	2880	504	Koloni oluşumu gözlenmedi
III.ekim	10-4	10-5	10-6
210	520	152	42
240	450	203	35
270	Sayılamayacak kadar çok	Sayılamayacak kadar çok	704

• Ortalama bakteri koloni sayılarının zamana göre grafiği Şekil 4'teki gibidir.

Şekil 4 : koloni sayısı-zaman grafiği

TARTIŞMA

Yetiştirilecek olan bakteriler E.coli olduğu için bu bakjterinin yetişebileceği uygun besiyeri çeşiti olan LB-agar besiyeri kullanıldı ve bu bakteriden başka bakterilerin besiyerinde üremesi istenilen bir durum olmadığı için plate'lere antibiyotik (streptomisin) eklendi.

Bir gece inkübasyona bırakılan bakteri kültüründen yapılan aşılamadan sonra kültürün tekrar shaker'a konulmasına dikkat edildi. Bunun sebebi bakterilerin SOB besiyeri içinde hemen dibe çökmesini engellemektir.

Plate'lere ekim sırasında kullanılan cam spatulanın sterilasyonunun sağlanması amacıyla alkol kullanılmıştır ve ekim işlemi ateşe (ispirto ocağına) yakın yerde yapılmıştır. Böylece ısınan havanın yükselip yakınındaki hava akımını ateşe doğru çekmesinden yaralanılarak havadaki mikroorganizmaların ölmesi ve plate'lerdeoluşabilecek kontaminasyonların önlenmesi sağlanmıştır. Alkolden alındıktan sonra cam spatulanın sıcaklığının bakterileri öldürmesini engellemek amacıylacam spatula plate'in üst kapağına dokundurulmuş ve soğutulmuştur.

Ekim işlemlerinin 30 dk lık aralıklarla yapılmasının sebebi bakterinin üreyeceği en iyi ortam şartlarınıbelirlemektir. Yine bu amaçla Farklı 3 dilüsyon oranında ekim yapılmıştır. Bu ekim işlemleri her seferinde 3 farklı dilüsyonda yapılmıştr. Bunun sebebi de hata payını en aza indirmektir.

Bakterilerin bir günlük inkübasyonundan sonra koloni sayımları yapılırken şekil 5 teki gibi sayılamayacak kadarçok üreyen bakteri plate'leri ve şekil 6 daki gibi hiç üremeyen bakteri plate'leri gözlemlenmiştir. Çok fazla üreyen bakterilerin dilüsyon oranları o zaman aralığındaki en yüksek değerde olduğu için çok fazla bakterinin ekildiği söylenebilir. Şekil 6 daki gibi hiç üreme olmayan plate'lerin görülmesinin sebebi de bakteri ekimi sırasında yapılan hatalar olabilir; mikropipetle besiyerinin çekilememi, cam çubuğun yeterince soğutulmamasından kaynaklı bakteri ölümleri vs.

KAYNAKLAR

•  Madigan M, Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed. bas.). Prentice Hall.
• GÖNÜL ŞA ve TOSUN H. (2005) The Effect of Acid Adaptation Conditions on Acid Tolerance Response of Escherichia coli O157: H7, TUBİTAK
• Arnold KW, Kaspar CW. Starvation and stationary phase induced acid tolerance in Escherichia coli O157: H7. Appl. and Environ. Microbiol 61: 2037-2039,1995.
• BAUER, J.D., Clinical Laboratory Methods, C.V. Mosby Company, St. Louis, Toronto, London, 1982
• Anderson, E. H. (1946). Growth requirement of virus-resistant mutants of Escherichia coli strain B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128.
• Şekil 1: http://www.genetic-testings.com/readytouse-reagents/41/ (26.03.2013)