14 Temmuz 2013 Pazar

TRANSFORM TOP10 KÜLTÜRÜ EKİMİ


GİRİŞ:
Lysogeny broth (LB) Medium: Besin değeri zengin bir bakteri büyüme ortamıdır. Giuseppe Bertani tarafından oluşturulmuştur. Escherichia coli ekimi için bir standardizasyonu geliştirilmiş ve endüstriyel üretimi yapılmaya başlanmıştır. Şekil 1 deki gibi renk ve görünümde olan besiyerinin farklı formülasyonları bulunmaktadır ama içerisinde genel olarak büyümeyi teşvik etmek için kullanılan
Peptitler ve kazein peptonlar
Vitaminler (B vitaminleri dahil)
Eser elementler (örneğin azot, kükürt, magnezyum)
Mineraller
Peptitler ve peptonlar tripton bulunmaktadır.

YÖNTEM
  • Gece boyunca inkübe edilmiş TOP10 hücre kültüründen mikropipet yardımıyla 40ul alınarak içerisinde 15 ml SOB bulunan falkona aşılama yapıldı.
  • Hemen ardından falkondan 20 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 180ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
  • Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diğer elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
  • Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
  • Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
  • İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
  • Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 4 defa daha tekrar edildi.
  • Shaker dan çıkarılan falkondan 2 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 198ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
  • Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
  • Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
  • Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
  • İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
  • Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 3 defa daha tekrar edildi.
  • Tekrar shaker dan çıkarılan falkondan 1 ul alınarak boş bir eppendorfa aktarıldı ve üzerine 999ul SOB eklendi ve bı karışımdan 100 ul alınarak üzerine dilüsyon oranı, tarih ve dülüsyon oranı yazılan LB-agar (+ strep) in ortasına boşaltıldı.
  • Beherde ve EtOH içerisinde bulunan cam çubuk alkolden alınarak ateşe tutularak steril edildi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan 100 ul karışımın üzerine 900ul SOB eklendi ve karışımdan 100 ul başka bir plate'e eklendi.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Eppendorfta kalan karışımdan 10 ul alınarak temiz bir eppendorfa eklendi ve üzerine 90 ul SOB eklendi ve karışımın tamamı başka bir plate'e boşaltıldı.
  • Plate ateşe yakın yerde tutuldu ve kapağı bir elle yavaşça yarısına kadar, cam çubuğun iki yüzüde kapağa değdirilerek soğutuldu.
  • Plate'in alt kapağı yavaşça döndürülürken diper elle de cam spatula ileri geri götürülerek plate'in ortasına bırakılmış olan bakterilerin plate'in her yerine yayılması sağlandı.
  • Bu sırada aşılama yapılmış falkondan 100 ul mikropipet yardımıyla alınarak temiz bir eppendorf tüpe aktarıldı ve üzerine 900 ul SOB eklendi. Falkon tekrar shaker a konuldu.
  • Spesktrofotometre cihazının dalga boyu değeri 560 nm ye ayarlandı ve içerisine SOB eklenen cam küvet blank olarak kullanılarak örneğin absorbans değeri ölçüldü.
  • Kalan örnekten 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda onun da absorbansı ölçüldü.
  • İçerisinden 100 ul alınarak içerisinde 900 ul SOB bulunan eppendorfa eklendi ve aynı dalga boyunda absorbansı ölçüldü ve değerler not edildi.
  • Bu işlem 30 dk lık aralıklarla 3 defa daha tekrar edildi.
  • Ekim yapılan plate'ler 37ºC deki etüve konuldu.
  • Yaklaşık 24 saat sonra plate'lerde üremiş olan bakteri kolonilerinin sayımı yapıldı.

BULGULAR

  • Besiyerine ekildikten yaklaşık 24 saat sonra besiyerinde üreyen bakteri kolonileirnin plate'lerdeki görünümü Şekil 2 deki gibidir.

Şekil 2 : LB-Agar besiyerinde 24 saatlik inkübasyondan sonra plate'lerin görünümü

  • Ekim yapılan her koşulda hazırlanan dilüsyon oranlarındaki örneklerin 560 nm deki OD değerleri tablo 1 deki gibi bulunmuştur. Her 30 dk lık zaman dilimi için yapılan 3 ayrı dilüsyonun aritmetik ortalaması alınmıştır. Ortalamanın alınma şekli:
0. dakika için; (0,09 +0,08+0,09) / 3 = 0,086

Tablo 1: Örneklerin 560 nm'deki Absorbans değerleri
Deney Süresi (dk)
%10'lik dilüsyon
%1'lik dilüsyon
%0.1'lik dilüsyon
Ortalama OD
0
0,09
0,08
0,09
0,09
30
0,09
0,09
0,09
0,09
60
0,11
0,08
0,08
0,09
90
0,09
0,1
0,11
0,1
120
0,09
0,08
0,08
0,08
150
0,1
0,09
0,11
0,1
180
0,14
0,08
0,08
0,1
210
0,17
0,11
0,1
0,13
240
0,13
0,1
0,08
0,1
270
0,21
0,09
0,11
0,14

  • Belirlenen ortalama değerlere göre OD değerlerinin zamana bağlı değişimini gösteren
    grafik şekil 3 teki gibi bulunmuştur

  • Yapılan ekimlerde dilüsyon oranslarına göre inkübasyondan sonra yapılan koloni sayımlarının sonuçları ve her zaman aralığında yapılan üç ekimin ortalama koloni sayısı değeri tablo 2 deki gibidir.

Tablo 2 : Plate'lerde oluşan koloni sayıları
Deney süresi (dk)
Koloni sayısı
I.ekim
10-2
10-3
10-4
0
736
3936
900
30
896
1280
680
60
808
1360
204
90
5120
2112
872
II.ekim
10-3
10-4
10-5
120
2096
144
24
150
2288
504
42
180
2880
504
Koloni oluşumu gözlenmedi
III.ekim
10-4
10-5
10-6
210
520
152
42
240
450
203
35
270
Sayılamayacak kadar çok
Sayılamayacak kadar çok
704

  • Ortalama bakteri koloni sayılarının zamana göre grafiği Şekil 4'teki gibidir.

Şekil 4 : koloni sayısı-zaman grafiği


TARTIŞMA

Yetiştirilecek olan bakteriler E.coli olduğu için bu bakjterinin yetişebileceği uygun besiyeri çeşiti olan LB-agar besiyeri kullanıldı ve bu bakteriden başka bakterilerin besiyerinde üremesi istenilen bir durum olmadığı için plate'lere antibiyotik (streptomisin) eklendi.

Bir gece inkübasyona bırakılan bakteri kültüründen yapılan aşılamadan sonra kültürün tekrar shaker'a konulmasına dikkat edildi. Bunun sebebi bakterilerin SOB besiyeri içinde hemen dibe çökmesini engellemektir.

Plate'lere ekim sırasında kullanılan cam spatulanın sterilasyonunun sağlanması amacıyla alkol kullanılmıştır ve ekim işlemi ateşe (ispirto ocağına) yakın yerde yapılmıştır. Böylece ısınan havanın yükselip yakınındaki hava akımını ateşe doğru çekmesinden yaralanılarak havadaki mikroorganizmaların ölmesi ve plate'lerdeoluşabilecek kontaminasyonların önlenmesi sağlanmıştır. Alkolden alındıktan sonra cam spatulanın sıcaklığının bakterileri öldürmesini engellemek amacıylacam spatula plate'in üst kapağına dokundurulmuş ve soğutulmuştur.

Ekim işlemlerinin 30 dk lık aralıklarla yapılmasının sebebi bakterinin üreyeceği en iyi ortam şartlarınıbelirlemektir. Yine bu amaçla Farklı 3 dilüsyon oranında ekim yapılmıştır. Bu ekim işlemleri her seferinde 3 farklı dilüsyonda yapılmıştr. Bunun sebebi de hata payını en aza indirmektir.

Bakterilerin bir günlük inkübasyonundan sonra koloni sayımları yapılırken şekil 5 teki gibi sayılamayacak kadarçok üreyen bakteri plate'leri ve şekil 6 daki gibi hiç üremeyen bakteri plate'leri gözlemlenmiştir. Çok fazla üreyen bakterilerin dilüsyon oranları o zaman aralığındaki en yüksek değerde olduğu için çok fazla bakterinin ekildiği söylenebilir. Şekil 6 daki gibi hiç üreme olmayan plate'lerin görülmesinin sebebi de bakteri ekimi sırasında yapılan hatalar olabilir; mikropipetle besiyerinin çekilememi, cam çubuğun yeterince soğutulmamasından kaynaklı bakteri ölümleri vs.

KAYNAKLAR

  •  Madigan M, Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed. bas.). Prentice Hall.
  • GÖNÜL ŞA ve TOSUN H. (2005) The Effect of Acid Adaptation Conditions on Acid Tolerance Response of Escherichia coli O157: H7, TUBİTAK
  • Arnold KW, Kaspar CW. Starvation and stationary phase induced acid tolerance in Escherichia coli O157: H7. Appl. and Environ. Microbiol 61: 2037-2039,1995.
  • BAUER, J.D., Clinical Laboratory Methods, C.V. Mosby Company, St. Louis, Toronto, London, 1982
  • Anderson, E. H. (1946). Growth requirement of virus-resistant mutants of Escherichia coli strain B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128.
Gönderen zaman:

Hiç yorum yok:

Yorum Gönder

Kaydol: Kayıt Yorumları (Atom)