MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ II
DENEY 6
AMAÇ
Bu deneyde amacımız;
izole edilen protein fraksiyonlarının western blotlama tekniğiyle
bir membrana aktarılıp, proteinleri membranda görüntülemek ve
özellikle izole edilmek istenilen proteinin özelliklerini
kullanarak izole edilip edilmediğini öğrenmektir.
GİRİŞ
Proteinler
tanımlanmaya çalışılırken çeşitli proteinleri içeren protein
fraksiyonları elde edilir ve bu fraksiyon içerisinden hedeflenen
proteinin varlığı büyüklüğüne, şekline, yüküne veya
izoelektrik noktasına göre belirlenir. Ayrımın yapılmasının
istenildiği özelliğe göre seçilen elektroforez uygulaması ile
belirlenen proteinin özgün şekilde saptanmasını sağlamak için
uygulanan yöntemlerden biri olan western blotlama, en genel ifade
olarak proteinlerin bir membrana yüklenerek spesifik özellikleri
kullanılarak belirlenmesidir. Bir protein solüsyonunda,
aranan bir proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu
anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle HIV (+) bulunan
örneklerin doğrulanmasında başvurulur.
Western
blotlama; elektroforez işlemiyle poliakrilamid jelde göç ettirilen
proteinlerin, destek membrana transfer edilmesi ve membrandaki
proteinlerin immünolojik metodlarla gösterilmesidir. Western blot
tekniği, denatüre edilen DNA'nın nitroselüloz membrana transfer
edildikten sonra hibridizasyonla tespit edildiği Southern blot
tekniğinin modifikasyonudur.
Resim
1
: Jeldeki
proteinlerin membrana transferi için kullanılacak düzenek
Yapılan
çalışmalarda western blot tekniğinin özellikle ELISA testinde
kullanılmasının sebebinin aynı ailenin türleri arasında
sıklıkla şekillenen çapraz reaksiyondan dolayı serolojik
testlerde karşılaşılan problemleri giderebilir olduğu
gözlemlenmiştir. Bu tür üstün özelliklerine rağmen bu tekniğin
uygulanması uzun süre almaktadır ve pahalıdır. Bu durum western
blotlama tekniğinin diğer serolojik testlere göre, özellikle tanı
amaçlı kullanımının az olmasının başlıca sebebidir. Son
yıllarda trasnfer edilmiş membranların uzun süre muhafaza
edilebilmesi özelliğinden yararlanılarak, pek çok virüs için
kullanıma hazır ticari western blot kitleri geliştirilmiştir. Bu
gelişmelerler tekniğin, özellikle tanı amacıyla daha sık
kullanılması sağlanmıştır.
Resim 2 : Western
blotlama tekniğinin genel çalışma mekanizması
Western blotlamanın yapılışı jelden
membrana proteinlerin geçirilmesini sağlayan yönteme göre iki
grupta incelenir.
- Pasif blotlama
- Elektro blotlama
- ıslak blotlama
- yarı kuru blotlama
MATERYALLER
Kimyasal
malzemeler:
Akrilamid:bisakrlamid(29:1)
Akrlamid:30.0 g
Bisakrilamid:0.8 g
dH2O
:100ml
Ayırma jeli
tamponu 4X:1.5M Tris PH 8.8
Tris :18.17 g
SDS (%10):4 ml
Vt:100 ml
Yükleme jeli
tamponu 4X :0.5 M Tris ph 6.8
Tris:6.06 g
SDS (%10):4ml
Vt:100ml
Amonyumpersülfat:10mg/ml
SDS :%10(w/v)
Elektrod
tamponu:25mM Tris (ph 8.3)250mM glycine %0.1 SDS
Tris:3.0 g
SDS(%10):1.0 g
Glycine :18.7 g
Vt :11
Örnek tamponu 2X
Yükleme jeli
tamponu :1.25ml
SDS :0.3 g
2-merkaptoetanol:
0.5 ml
Glycerol :1.0 ml
BPB:0.01 g
Vt: 5.0 ml
Jel hazırlanması:
Ayırma jeli(%12)
Ayırma jeli tamponu
4X :3.75 ml
Akrilamid-bisakrilamid
(29:1): 6.3 ml
TEMED:15 µl
APS:225 µl
dH2O :13.2 ml
Yükleme jeli
(%4)
Yükleme jeli
tamponu 4X: 940 µl
Akrilamid-bisakrilamid
(29:1): 750 µl
TEMED: 5 µl
APS: 35 µl
dH2O : 3.3 ml
western transfer
tamponu:14.4g
glisin+3.0 tris base+11dH2O
içinde çözülür.
MeOH :500 ml
Asetikasit :140 ml
Gliserol :100 ml
Vt :21
Boyama solüsyonu
1.25 g Coomassie Blue R 250 ,500 ml yıkama solüsyonunda çözülür.
panceasu
s boyası:
%10
luk aseetik asit içinde haırlanmış %2 (w/v) ponceaus
Coomassie
Boya Çözeltisi
Laboratuvar
Cihazları :
Elektroforez
METOD
- Ayırma jeli olarak kullanılacak jel camlar arasına döküldü. Daha sonra su ile doldurulmuş butanol damlatıldı.
- Oksijenle teması kesilen jelin düz bir yüzey oluşturması sağlandı.
- Polimerizasyonun gerçekleşmesi için 30-45 dakika arasında beklenildi.
- Butanol suyla temizlendi, yükleme jeli döküldü ve taraklar jele sokularak 20-30 dakika polimerizasyon beklenildi.
- Protein fraksiyonları yükleme tamponuyla eşit hacimde karıştırılarak 80ºC da 2 dakika denatüre edilip hemen jele yüklendi.
- Elektroforez başlatılır. Voltaj önce 100V'a sonra da 150 V 'a yükseltilerek yürütülür.
- Plastik aparat kullanılarak yükleme jelinin bulunduğu kısım atılır.
- Jel, yine plastik aparat kullanılarak camdan ayrılır.
- Kullanılacak PVDF membran, MeOH ile ıslatılır, daha sonra da distile su ile yıkanır.
- İki teflon sünger, membran ve 6 adet, jel büyüklüğünde kesilmiş Whatmann (3MM) filtre kağıdı transfer tamponunda ıslatılır.
- Blotlama düzeneği anod ucunun-teflon-sünger- whatman kağıdı- PVDF membran- SDS PAGE jel- Whatman kağıdı- teflon sünger- katot ucu olarak alttan üste doğru sıralandı.
- Hazırlanan blotlama kaseti tanka yerleştirildi ve aktarım 100 V da 1 saat olarak yapıldı.
- 1 saat sonunda membran temiz bir kaba alındı
- Üzerine Ponceau çözeltisi dökülerek 1-2 dakika boyandı.
- Boyalı membranın durumu gözlemlendi.
- Membran distile su ile yıkandı. Tekrar gözlem yapıldı.
- Membran Coomassie boya çözeltisi ile 30 dakika boyandı.
- Yıkama solüsyonu ile yıkandı.
SONUÇLAR
Jel üzerindeki
proteinler Ponceau çözeltisiyle boyandıktan sonra resim 3 deki
görüntü elde edildi. İncelenen jelin pembe renkte ve üzerinde
beyaz, leke şeklinde bölümler gözlemlendi. Jel üzerinde protein
olduğu söylenebilecek herhangi bir çizgi belirmedi.
Protein
fraksiyonlarının olduğuna dair bir iz görüntelenemediği için
Coomassie boya çözeltisi ile boyanan jelde de protein olduğuna
dair bir çizgi görülemedi. Coomassie ile boyanan jelin şekil 3
deki gibi renklendiği ve yine aynı beyaz lekelerin belirgin olduğu
gözlemlendi.
TARTIŞMA
PVDF
membrana aktarılan proteinler kırmızı renkli Ponceau boyası ile
boyandıktan sonra ponceau boyasının etkisiyle pembe renkte olan
memranda beyaz lekeler gözlemlendi. Bunun sebebi protein
fraksiyonlarının jelden membrana aktarılırken arada hava
boşluklarının kalması olabilir. Ayrıca pembe renkli hal alan
membranda protein fraksiyonlarının koyu pembe renkte gözlemlenmesi
gerekmektedir. Böyle bir görüntü elde edilemedi.
Protein fraksiyonlarının görüntülenemediği
jel iyice yıkandıktan sonra protein fraksiyonlarının daha iyi
görüntülenmelerini sağlamak amacıyla membran Coomassie boya
çözeltisiyle boyandığında resim 5 teki gibi bir görüntü elde
edilmeliydi fakat yine membranda protein fraksiyonları
gözlemlenmedi. Bunun sebebi proteinlerin jele transfer edilememiş
olması, protein fraksiyonlarının konsantrasyonunun az olması ya
da yüksek voltaj olduğu için proteinlerin jelde yürüyüp çıkıp
tampona karışmış olması olabilir.
Daha önce yapılan absorbans ölçümünde
protein konsantrasyonunun yüksek olduğu saptandığı için
proteinlerin membranda görüntelenememesinin sebebi konsantrasyonun
az olduğu ihtimali olamaz. Ayrıca konsantrasyonun yüksek olan
proteinler elektroforez sırasında jele aktarılırken yine bu
yüksek konsantrasyonlu protein fraksiyonu kullanıldığı için ve
yükleme jelinde gözlemlendikleri için proteinlerin jele
yüklenemediği de söylenemez.
Resim 5 : Coomassie
boya çözeltisiyle boyanan ve yıkanmış membran görüntüsü.
Coomassie boya çözeltisiyle boyanan
membranda membranın üzerinde protein olmadığı sonucuna
varılmasının sebebi; 100V olarak uygulanan elektroforez voltajının
yarattığı akım yani oluşan yürüme hızının bu protein
fraksiyonunun yürütülmesi için yüksek bir değer olmasıdır. Bu
yüzden proteinler elektroforez sırasında jelden yürüyüp,
çıkmışlar ve tampona karışmışlardır.
REFERANSLAR
- http://tr.wikipedia.org/wiki/Western_blot (30.04.2012)
- http://www.elec-intro.com/western-blotting-ecl (30.04.2012)
- http://www.norbil.hacettepe.edu.tr/west_ornek.shtml (30.04.2012)
- Resim 1 :http://en.wikipedia.org/wiki/File:Western_blotting_3.svg (30.04.2012)
- Resim2:http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/Westernblot.html (30.04.2012)
-
(30.04.2012)
- Resim 5 : http://www.elec-intro.com/western-blotting-ecl (30.04.2012)
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder