3 Ağustos 2012 Cuma

WESTERN BLOTLAMA






MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ II
DENEY 6 

AMAÇ
Bu deneyde amacımız; izole edilen protein fraksiyonlarının western blotlama tekniğiyle bir membrana aktarılıp, proteinleri membranda görüntülemek ve özellikle izole edilmek istenilen proteinin özelliklerini kullanarak izole edilip edilmediğini öğrenmektir.

GİRİŞ
Proteinler tanımlanmaya çalışılırken çeşitli proteinleri içeren protein fraksiyonları elde edilir ve bu fraksiyon içerisinden hedeflenen proteinin varlığı büyüklüğüne, şekline, yüküne veya izoelektrik noktasına göre belirlenir. Ayrımın yapılmasının istenildiği özelliğe göre seçilen elektroforez uygulaması ile belirlenen proteinin özgün şekilde saptanmasını sağlamak için uygulanan yöntemlerden biri olan western blotlama, en genel ifade olarak proteinlerin bir membrana yüklenerek spesifik özellikleri kullanılarak belirlenmesidir.  Bir protein solüsyonunda, aranan bir proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle HIV (+) bulunan örneklerin doğrulanmasında başvurulur.
Western blotlama; elektroforez işlemiyle poliakrilamid jelde göç ettirilen proteinlerin, destek membrana transfer edilmesi ve membrandaki proteinlerin immünolojik metodlarla gösterilmesidir. Western blot tekniği, denatüre edilen DNA'nın nitroselüloz membrana transfer edildikten sonra hibridizasyonla tespit edildiği Southern blot tekniğinin modifikasyonudur.
Resim 1 : Jeldeki proteinlerin membrana transferi için kullanılacak düzenek


Yapılan çalışmalarda western blot tekniğinin özellikle ELISA testinde kullanılmasının sebebinin aynı ailenin türleri arasında sıklıkla şekillenen çapraz reaksiyondan dolayı serolojik testlerde karşılaşılan problemleri giderebilir olduğu gözlemlenmiştir. Bu tür üstün özelliklerine rağmen bu tekniğin uygulanması uzun süre almaktadır ve pahalıdır. Bu durum western blotlama tekniğinin diğer serolojik testlere göre, özellikle tanı amaçlı kullanımının az olmasının başlıca sebebidir. Son yıllarda trasnfer edilmiş membranların uzun süre muhafaza edilebilmesi özelliğinden yararlanılarak, pek çok virüs için kullanıma hazır ticari western blot kitleri geliştirilmiştir. Bu gelişmelerler tekniğin, özellikle tanı amacıyla daha sık kullanılması sağlanmıştır.


Resim 2 : Western blotlama tekniğinin genel çalışma mekanizması
Western blotlamanın yapılışı jelden membrana proteinlerin geçirilmesini sağlayan yönteme göre iki grupta incelenir.
  • Pasif blotlama
  • Elektro blotlama
  1. ıslak blotlama
  2. yarı kuru blotlama

MATERYALLER

Kimyasal malzemeler:
Akrilamid:bisakrlamid(29:1)
Akrlamid:30.0 g
Bisakrilamid:0.8 g
dH2O :100ml

Ayırma jeli tamponu 4X:1.5M Tris PH 8.8
Tris :18.17 g
SDS (%10):4 ml
Vt:100 ml

Yükleme jeli tamponu 4X :0.5 M Tris ph 6.8
Tris:6.06 g
SDS (%10):4ml
Vt:100ml

Amonyumpersülfat:10mg/ml

SDS :%10(w/v)

Elektrod tamponu:25mM Tris (ph 8.3)250mM glycine %0.1 SDS
Tris:3.0 g
SDS(%10):1.0 g
Glycine :18.7 g
Vt :11

Örnek tamponu 2X
Yükleme jeli tamponu :1.25ml
SDS :0.3 g
2-merkaptoetanol: 0.5 ml
Glycerol :1.0 ml
BPB:0.01 g
Vt: 5.0 ml
Jel hazırlanması:
Ayırma jeli(%12)
Ayırma jeli tamponu 4X :3.75 ml
Akrilamid-bisakrilamid (29:1): 6.3 ml
TEMED:15 µl
APS:225 µl
dH2O :13.2 ml

Yükleme jeli (%4)
Yükleme jeli tamponu 4X: 940 µl
Akrilamid-bisakrilamid (29:1): 750 µl
TEMED: 5 µl
APS: 35 µl
dH2O : 3.3 ml

western transfer tamponu:14.4g glisin+3.0 tris base+11dH2O içinde çözülür.

Yıkama solüsyonu
MeOH :500 ml
Asetikasit :140 ml
Gliserol :100 ml
Vt :21
Boyama solüsyonu 1.25 g Coomassie Blue R 250 ,500 ml yıkama solüsyonunda çözülür.

panceasu s boyası: %10 luk aseetik asit içinde haırlanmış %2 (w/v) ponceaus
Coomassie Boya Çözeltisi
Laboratuvar Cihazları :
Elektroforez
METOD
  • Ayırma jeli olarak kullanılacak jel camlar arasına döküldü. Daha sonra su ile doldurulmuş butanol damlatıldı.
  • Oksijenle teması kesilen jelin düz bir yüzey oluşturması sağlandı.
  • Polimerizasyonun gerçekleşmesi için 30-45 dakika arasında beklenildi.
  • Butanol suyla temizlendi, yükleme jeli döküldü ve taraklar jele sokularak 20-30 dakika polimerizasyon beklenildi.
  • Protein fraksiyonları yükleme tamponuyla eşit hacimde karıştırılarak 80ºC da 2 dakika denatüre edilip hemen jele yüklendi.
  • Elektroforez başlatılır. Voltaj önce 100V'a sonra da 150 V 'a yükseltilerek yürütülür.
  • Plastik aparat kullanılarak yükleme jelinin bulunduğu kısım atılır.
  • Jel, yine plastik aparat kullanılarak camdan ayrılır.
  • Kullanılacak PVDF membran, MeOH ile ıslatılır, daha sonra da distile su ile yıkanır.
  • İki teflon sünger, membran ve 6 adet, jel büyüklüğünde kesilmiş Whatmann (3MM) filtre kağıdı transfer tamponunda ıslatılır.
  • Blotlama düzeneği anod ucunun-teflon-sünger- whatman kağıdı- PVDF membran- SDS PAGE jel- Whatman kağıdı- teflon sünger- katot ucu olarak alttan üste doğru sıralandı.
  • Hazırlanan blotlama kaseti tanka yerleştirildi ve aktarım 100 V da 1 saat olarak yapıldı.
  • 1 saat sonunda membran temiz bir kaba alındı
  • Üzerine Ponceau çözeltisi dökülerek 1-2 dakika boyandı.
  • Boyalı membranın durumu gözlemlendi.
  • Membran distile su ile yıkandı. Tekrar gözlem yapıldı.
  • Membran Coomassie boya çözeltisi ile 30 dakika boyandı.
  • Yıkama solüsyonu ile yıkandı.
SONUÇLAR
Jel üzerindeki proteinler Ponceau çözeltisiyle boyandıktan sonra resim 3 deki görüntü elde edildi. İncelenen jelin pembe renkte ve üzerinde beyaz, leke şeklinde bölümler gözlemlendi. Jel üzerinde protein olduğu söylenebilecek herhangi bir çizgi belirmedi.

Protein fraksiyonlarının olduğuna dair bir iz görüntelenemediği için Coomassie boya çözeltisi ile boyanan jelde de protein olduğuna dair bir çizgi görülemedi. Coomassie ile boyanan jelin şekil 3 deki gibi renklendiği ve yine aynı beyaz lekelerin belirgin olduğu gözlemlendi.


TARTIŞMA
PVDF membrana aktarılan proteinler kırmızı renkli Ponceau boyası ile boyandıktan sonra ponceau boyasının etkisiyle pembe renkte olan memranda beyaz lekeler gözlemlendi. Bunun sebebi protein fraksiyonlarının jelden membrana aktarılırken arada hava boşluklarının kalması olabilir. Ayrıca pembe renkli hal alan membranda protein fraksiyonlarının koyu pembe renkte gözlemlenmesi gerekmektedir. Böyle bir görüntü elde edilemedi.
Protein fraksiyonlarının görüntülenemediği jel iyice yıkandıktan sonra protein fraksiyonlarının daha iyi görüntülenmelerini sağlamak amacıyla membran Coomassie boya çözeltisiyle boyandığında resim 5 teki gibi bir görüntü elde edilmeliydi fakat yine membranda protein fraksiyonları gözlemlenmedi. Bunun sebebi proteinlerin jele transfer edilememiş olması, protein fraksiyonlarının konsantrasyonunun az olması ya da yüksek voltaj olduğu için proteinlerin jelde yürüyüp çıkıp tampona karışmış olması olabilir.
Daha önce yapılan absorbans ölçümünde protein konsantrasyonunun yüksek olduğu saptandığı için proteinlerin membranda görüntelenememesinin sebebi konsantrasyonun az olduğu ihtimali olamaz. Ayrıca konsantrasyonun yüksek olan proteinler elektroforez sırasında jele aktarılırken yine bu yüksek konsantrasyonlu protein fraksiyonu kullanıldığı için ve yükleme jelinde gözlemlendikleri için proteinlerin jele yüklenemediği de söylenemez.
Resim 5 : Coomassie boya çözeltisiyle boyanan ve yıkanmış membran görüntüsü.

Coomassie boya çözeltisiyle boyanan membranda membranın üzerinde protein olmadığı sonucuna varılmasının sebebi; 100V olarak uygulanan elektroforez voltajının yarattığı akım yani oluşan yürüme hızının bu protein fraksiyonunun yürütülmesi için yüksek bir değer olmasıdır. Bu yüzden proteinler elektroforez sırasında jelden yürüyüp, çıkmışlar ve tampona karışmışlardır.

REFERANSLAR
Gönderen zaman:

Hiç yorum yok:

Yorum Gönder

Kaydol: Kayıt Yorumları (Atom)